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De la santé à l’énergie en passant par l’informatique ou la chimie, les recherches menées dans les labos trouvent régulièrement des prolongements dans le monde socio-économique. Découvrez sur ce blog des exemples de valorisation des recherches menées au CNRS, une des institutions les plus innovantes au monde.

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SideROS, la start-up qui croise le fer contre le cancer
10.02.2020, par Martin Koppe
Mis à jour le 04.03.2020
Basée sur les travaux de Raphaël Rodriguez, directeur de recherche au CNRS, la start-up SideROS développe de nouvelles stratégies anticancéreuses qui ciblent le fer contenu dans les cellules souches résistantes aux traitements.

Toutes sortes de cellules peuvent devenir cancéreuses, et elles présentent un niveau de menace différent. À la fois résistantes, actives et mobiles, les cellules souches cancéreuses font croître les tumeurs et provoquent des récidives de cancer, même après traitement. Elles forment ainsi des cibles importantes pour la recherche.

Des molécules pour capturer le fer
« Ces cellules cancéreuses résistantes contiennent plus de fer et sont métaboliquement plus actives que les autres, explique Raphaël Rodriguez, directeur de recherche CNRS au laboratoire Chimie et biologie de la cellule1. Nous avons donc décidé de les attaquer par cet angle. » Raphaël Rodriguez a choisi l’ironomycine, petite molécule de synthèse dérivée de la salinomycine conçue dans son laboratoire, qu’il a brevetée. Le produit naturel ainsi que ce dérivé de synthèse bloquent le fer lysosomal et perturbent l’homéostasie de la cellule. L’accumulation de ce métal entraîne la production d’espèce réactives de l’oxygène toxiques pour la tumeur. Cela finit par enclencher le processus de mort cellulaire des cellules souches cancéreuses.
 

Microscopie à fluorescence d'un modèle de cellules souches cancéreuses. Autour du noyau, en bleu, on voit une co-localisation entre l'ironomycine, en vert et les lysosomes (organites cellulaires qui permettent la digestion intracellulaire grâce à des enzymes), en rouge.
Microscopie à fluorescence d'un modèle de cellules souches cancéreuses. Autour du noyau, en bleu, on voit une co-localisation entre l'ironomycine, en vert et les lysosomes (organites cellulaires qui permettent la digestion intracellulaire grâce à des enzymes), en rouge.
Sebastian MULLER
Sebastian MULLER

Forts de cette piste extrêmement prometteuse et inédite, Raphaël Rodriguez et Robin Rivaton, économiste et essayiste, ont fondé une start-up pour valoriser l’ironomycine. « Il a d’abord fallu publier beaucoup de travail académique, puis discuter avec des contacts dans les biotechnologies et les milieux économiques, se souvient le chimiste. Lancer une start-up demande le bon timing. Ni trop tôt ni trop tard. » Une approche d’influence anglo-saxonne, inspirée par son année de thèse à Oxford et ses sept années de postdoc à Cambridge.

SideROS naît alors en 2019, soutenue par le programme RISE de CNRS Innovation. Sideros signifie « fer » en grec, mais les trois dernières lettres sont ici capitalisées pour ROS : reactive oxygen species. Un terme qui désigne les dérivés réactifs de l’oxygène, comme les radicaux libres, formés en perturbant l’homéostasie du fer dans les cellules souches cancéreuses.

Cellules de cancer mammaire. À droite, l'état épithélial (cellules cancéreuses moins agressives) et à gauche, l'état mésenchymateux (cellules cancéreuses invasives, responsables des métastases). Les cellules dans l'état mésenchymateux sont plus sensibles à l'ironomycine.
Cellules de cancer mammaire. À droite, l'état épithélial (cellules cancéreuses moins agressives) et à gauche, l'état mésenchymateux (cellules cancéreuses invasives, responsables des métastases). Les cellules dans l'état mésenchymateux sont plus sensibles à l'ironomycine.
Stéphanie SOLIER
Stéphanie SOLIER

Reconnaissance académique et attractivité
La jeune pousse est en tout cas immédiatement repérée, et reçoit la même année le prix de la start-up innovante du prestigieux concours i-LAB, organisé par le ministère de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation, en partenariat avec la Banque publique d’investissement (BpiFrance). Toujours en 2019, Raphaël Rodriguez obtient non seulement le grand prix scientifique de la Fondation Charles Defforey, remis à l’Institut de France, mais aussi le Tetrahedron Young Investigator Award pour l'ensemble de ses travaux, prix international réservé aux chercheurs de moins de quarante ans. « Le concours i-Lab nous a offert une visibilité très importante, s’enthousiasme Lucie Mondoulet, Chief executive officer (CEO) de SideROS. Notre dossier a ainsi été reconnu par des experts scientifiques de très haut niveau, ce qui renforce la solidité de notre dossier pour la recherche de financement. »

Ancienne chercheuse en génie biochimique et alimentaire, spécialisée dans la désensibilisation aux allergies alimentaires, Lucie Mondoulet a créé en 2007 le département Recherche et Développement de DBV Technologies. Pendant les onze années où Lucie Mondoulet a dirigé ce département, la petite entreprise française d’une dizaine de personnes est passée à trois cents salariés, a été valorisée jusqu’à deux milliards d’euros et est toujours cotée au Nasdaq et à la Bourse de Paris, devenue Euronext.

« J’ai quitté DBV en 2018, pour reprendre un projet de recherche dès ses premières phases de découverte, avant toutes les étapes de développement nécessaires pour démarrer les essais cliniques, explique Lucie Mondoulet. C’est la période la plus critique, mais c’est aussi là où l’on retrouve le plus d’enjeux et de créativité, pour adapter ce projet de recherche en projet de développement de médicaments, ainsi que convaincre les investisseurs et partenaires industriels pour les premières étapes de financement de la société. »

Vers des essais cliniques sur les humains
Un ancien collègue de DBV l’avait mise en contact avec Raphaël Rodriguez, qui cherchait une personne expérimentée pour planifier comment amener ses molécules jusqu’aux essais cliniques. D’abord consultante, Lucie Mondoulet est devenue CEO de SideROS en septembre 2019. Pour les prochains mois, le travail consistera à industrialiser les procédés de fabrication maîtrisés à l’échelle du laboratoire et évaluer la toxicité de l’ironomycine avant une première administration chez le patient.

« Nos tests in vitro ont confirmé l’efficacité de la molécule sur des cellules de cancers hématologiques2, ainsi que de cancers solides tels que le glioblastome3 ou celui des ovaires, détaille Lucie Mondoulet. Nous avons aussi des preuves de concept précliniques in vivo sur des souris greffées avec une tumeur du sein, qui montrent qu’elle empêche la reprise tumorale. Nous espérons que les premiers essais cliniques sur les humains pourront commencer en 2022, qu’il faudra alors financer par une levée de fonds à hauteur de plusieurs dizaines de millions d’euros. » Le défi est ainsi triple : scientifique, financier et sanitaire. L’ironomycine recèle cependant bien assez de promesses pour que l’équipe de SideROS les relève tous. ♦

Notes
  • 1. Unité CNRS/Institut Curie/Inserm.
  • 2. La leucémie est un exemple de cancer hématologique.
  • 3. La forme la plus courante de tumeur au cerveau.
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Christian Mazuque le 18 Mars 2020 à 10h03
(19) EP 1 694 829 B1 (Cont. page suivante) &    (11) EP 1 694 829 B1 (12) FASCICULE DE BREVET EUROPEEN (45) Date de publication et mention de la délivrance du brevet: 04.08.2010 Bulletin 2010/31 (21) Numéro de dépôt: 04805625.3 (22) Date de dépôt: 02.12.2004 (51) Int Cl.: C12N 7/00(2006.01) (86) Numéro de dépôt international: PCT/FR2004/003106 (87) Numéro de publication internationale: WO 2005/056584 (23.06.2005 Gazette 2005/25) (54) NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU SRAS ET SES APPLICATIONS. NEUER MIT SARS VERBUNDEN CORONAVIRUS STAMM UND SEINE VERWENDUNGEN NOVEL STRAIN OF SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS AND APPLICATIONS THEREOF (84) Etats contractants désignés: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR (30) Priorité: 02.12.2003 FR 0314151 02.12.2003 FR 0314152 (43) Date de publication de la demande: 30.08.2006 Bulletin 2006/35 (60) Demande divisionnaire: 10005885.8 (73) Titulaires: • INSTITUT PASTEUR 75724 Paris Cedex 15 (FR) • CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) 75794 Paris Cedex 16 (FR) • UNIVERSITE PARIS VII 75251 Paris Cedex 05 (FR) (72) Inventeurs: • VAN DER WERF, Sylvie F-91190 Gif-sur-yvette (FR) • ESCRIOU, Nicolas F-75014 Paris (FR) • CRESCENZO-CHAIGNE, Bernadette F-92200 Neuilly-sur-seine (FR) • MANUGUERRA, Jean-Claude F-75018 Paris (FR) • KUNST, Frederik, Inst. Pasteur Bureau des Brevets et Inventions 75724 Paris Cedex 15 (FR) • CALLENDRET, Benoît F- 92000 Nanterre (FR) • BETTON, Jean-Michel 75014 Paris (FR) • LORIN, Valérie 92120 Montrouge (FR) • GERBAUD, Sylvie 94100 Saint Maur Des Fosses (FR) • BURGUIERE, Ana Maria 92140 Clamart (FR) • AZEBI, Saliha 94400 Vitry-sur-seine (FR) • CHARNEAU, Pierre 75005 Paris (FR) • TANGY, Frédéric 93260 Les Lilas (FR) • COMBREDET, Chantal 75017 Paris (FR) • DELAGNEAU, Jean-François 78170 La Celle Saint Cloud (FR) • MARTIN, Monique 92290 Chatenay Malabry (FR) (74) Mandataire: Marcadé, Véronique et al Cabinet Ores 36, rue de St Pétersbourg 75008 Paris (FR) (56) Documents cités: • DATABASE EMBL 22 avril 2003 (2003-04-22), XP002294758 Database accession no. AY278489 • DATABASE EMBL 10 juin 2003 (2003-06-10), XP002294760 Database accession no. AY290752 • DATABASE UNIPROT 10 octobre 2003 (2003-10-10), XP002294761 Database accession no. P59595 2 EP 1 694 829 B1 • MARRA M A ET AL: "The genome sequence of the SARS-associated coronavirus" SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE,, US, vol. 300, no. 5624, 30 mai 2003 (2003-05-30), pages 1399-1404, XP002269483 ISSN: 0036-8075 • CHE X-Y ET AL: "RAPID AND EFFICIENT PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS NUCLEOCAPSID PROTEIN BY IMMUNIZING MICE" DI YI JUNYI DAXUE XUEBAO - ACADEMIC JOURNAL OF FIRST MEDICAL COLLEGE OF PLA, GAI KAN BIANJISHI, GUANGZHOU, CN, vol. 23, no. 7, juillet 2003 (2003-07), pages 640-642, XP008028243 ISSN: 1000-2588 • WANG J ET AL: "ASSESSMENT OF IMMUNOREACTIVE SYNTHETIC PEPTIDES FROM THE STRUCTURAL PROTEINS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS" CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49, no. 12, 13 novembre 2003 (2003-11-13), pages 1989-1996, XP001182489 ISSN: 0009-9147 • SHI Y ET AL: "DIAGNOSIS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME (SARS) BY DETECTION OF SARS CORONAVIRUS NUCLEOCAPSID ANTIBODIES IN AN ANTIGENCAPTURING ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY" JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 41, no. 12, décembre 2003 (2003-12), pages 5781-5782, XP008028263 ISSN: 0095-1137 • LIU G ET AL: "The C-Terminal Portion of the Nucleocapsid Protein Demonstrates SARS-CoV Antigenicity" GENOMICS, PROTEOMICS AND BIOINFORMATICS, vol. 1, no. 3, 2003, pages 193-197, XP001183377 • POON LEO L M ET AL: "Rapid diagnosis of a coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS)" CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49, no. 6 Pt 1, juin 2003 (2003-06), pages 953-955, XP002288942 ISSN: 0009-9147 EP 1 694 829 B1 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Description [0001] La présente invention est relative à une nouvelle souche de coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), issue d’un prélèvement répertorié sous le n° 031589 et prélevé à Hanoi (Vietnam), à des molécules d’acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molécules d’acide nucléique ainsi qu’à leurs applications, notamment en tant que réactifs de diagnostic et/ou comme vaccin. [0002] Le coronavirus est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d’approximativement 30 kilobases qui se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes ; l’extrémité 5’ du génome a une structure en coiffe et l’extrémité 3’ comporte une queue polyA. Ce virus est enveloppé et comprend, à sa surface, des structures péplomériques dénommées spicules. [0003] Le génome comprend les cadres ouverts de lecture ou ORF suivants, de son extrémité 5’ vers son extrémité 3’ : ORF1a et ORF1b correspondant aux protéines du complexe de transcription-réplication, et ORF-S, ORF-E, ORFM et ORF-N correspondant aux protéines structurales S, E, M et N. Il comprend également des ORFs correspondant à des protéines de fonction inconnue codées par : la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant cette dernière, la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N, et la région incluse dans l’ORF-N. [0004] La protéine S est une glycoprotéine membranaire (200-220 kDa) qui se présente sous la forme de spicules ou "Spike" émergeant de la surface de l’enveloppe virale. Elle est responsable de l’attachement du virus aux récepteurs de la cellule hôte et de l’induction de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire. [0005] La petite protéine d’enveloppe (E) également dénommée sM (small membrane) qui est une protéine transmembranaire non glycosylée d’environ 10 kDa, est la protéine présente en plus faible quantité dans le virion. Elle joue un rôle moteur dans le processus de bourgeonnement des coronavirus qui se produit au niveau du compartiment intermédiaire dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi [0006] La protéine M ou protéine de matrice (25-30 kDa) est une glycoprotéine membranaire plus abondante qui est intégrée dans la particule virale par une interaction M/E, tandis que l’incorporation de S dans les particules est dirigée par une interaction S/M. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées. [0007] La protéine N ou protéine de nucléocapside (45-50 kDa) qui est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus, est nécessaire pour encapsider l’ARN génomique puis pour diriger son incorporation dans le virion. Cette protéine est vraisemblablement également impliquée dans la réplication de l’ARN. [0008] Lorsqu’une cellule hôte est infectée, le cadre de lecture (ORF) situé en 5’ du génome viral est traduit en une polyprotéine qui est clivée par les protéases virales et libère alors plusieurs protéines non-structurales telles que l’ARNpolymérase ARN dépendante (Rep) et l’ATPase hélicase (Hel). Ces deux protéines sont impliquées dans la réplication du génome viral ainsi que dans la génération de transcrits qui sont utilisés dans la synthèse des protéines virales. Les mécanismes par lesquels ces ARNms sub-génomiques sont produits, ne sont pas complètement compris ; cependant des faits récents indiquent que les séquences de régulation de la transcription à l’extrémité 5’ de chaque gène représentent des signaux qui régulent la transcription discontinue des ARNms sub-génomiques. [0009] Les protéines de la membrane virale (protéines S, E et M) sont insérées dans le compartiment intermédiaire, alors que l’ARN répliqué (brin +) s’assemble avec la protéine N (nucléocapside). Ce complexe protéine-ARN s’associe ensuite avec la protéine M incluse dans les membranes du réticulum endoplasmique et les particules virales se forment lorsque le complexe de la nucléocapside bourgeonne dans le réticulum endoplasmique. Le virus migre ensuite à travers le complexe du Golgi et éventuellement sort de la cellule, par exemple par exocytose. Le site de l’attachement du virus à la cellule hôte se trouve au niveau de la protéine S. [0010] Les coronavirus sont responsables de 15 à 30 % des rhumes chez l’Homme et d’infections respiratoires ou digestives chez les animaux, notamment le chat (FIPV : Feline infectious peritonitis virus), la volaille (IBV : Avian Infectious bronchitis virus), la souris (MHV : Mouse Hepatitis virus), le porc (TGEV : Transmissible gastroenterititis virus, PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV : Porcine Respiratory Coronavirus, HEV : Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) et les bovins (BcoV : Bovine coronavirus). [0011] En général, chaque coronavirus n’affecte qu’une seule espèce ; chez les individus immunocompétents, l’infection induit des anticorps éventuellement neutralisants et une immunité cellulaire, capables de détruire les cellules infectées. [0012] Une épidémie de pneumonie atypique, dénommée syndrome respiratoire aigu sévère (SARS ou Severe acute respiratory syndrome, SRAS en français) s’est propagée dans différents pays (Vietnam, Hong-Kong, Singapour, Thaïlande et Canada) au cours du premier trimestre 2003, à partir d’un foyer initial apparu en Chine dans le dernier trimestre de 2002. La sévérité de cette maladie est telle que son taux de mortalité est d’environ 3 à 6 %. La détermination de l’agent causatif de cette maladie a été entreprise par de nombreux laboratoires, à travers le monde. [0013] En mars 2003, un nouveau coronavirus (SARS-CoV, SARS virus ou virus SRAS, en français) a été isolé, en association avec des cas de syndrome respiratoire aigu sévère (T.G.KSIAZEK et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330 ; C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976 ; EP 1 694 829 B1 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-). [0014] Des séquences génomiques de ce nouveau coronavirus ont ainsi été obtenues, notamment celles de l’isolat Urbani (Genbank n° d’accès AY274119.3 et A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) et de l’isolat de Toronto (Tor2, Genbank n° d’accès AY 278741 et A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394-1399). [0015] L’organisation du génome est comparable à celle des autres coronavirus connus permettant ainsi de confirmer l’appartenance du SARS-CoV à la famille des Coronaviridae ; les cadres ouverts de lecture ORF1a et 1b et les cadres ouverts de lecture correspondant aux protéines S, E, M, et N, ainsi qu’à des protéines codées par : la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E (ORF3), la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E (ORF4), la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N (ORF7 à ORF11) et la région correspondant à l’ORF-N (ORF13 et ORF14), ont notamment été identifiées. [0016] Sept différences ont été mises en évidence entre les séquences des isolats Tor2 et Urbani ; 3 correspondent à des mutations silencieuses (c/t en position 16622 et a/g en position 19064 de l’ORF1b, t/c en position 24872 de l’ORFS) et 4 modifient la séquence en acides aminés de respectivement : les protéines codées par l’ORF1a (c/t en position 7919 correspondant à la mutation A/V), la protéine S (g/t en position 23220 correspondant à la mutation A/S), la protéine codée par l’ORF3 (a/g en position 25298 correspondant à la mutation R/G) et de la protéine M (t/c en position 26857 correspondant à la mutation S/P). [0017] En outre, l’analyse phylogénétique montre que le SARS-CoV est éloigné des autres coronavirus et qu’il est apparu, ni par mutation de coronavirus respiratoires humains, ni par recombinaison entre des coronavirus connus (pour une revue, voir Holmes, J.C.I., 2003, 111, 1605-1609). [0018] La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour la mise au point de réactifs de détection et de diagnostic du SRAS suffisamment sensibles et spécifiques ainsi qu’à des compositions immunogènes aptes à protéger des populations contre des épidémies de SRAS. [0019] Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une autre souche de coronavirus associé au SRAS, qui se distingue des isolats Tor2 et Urbani. [0020] La présente invention a donc pour objet, une souche isolée ou purifiée de coronavirus humain associé au syndrome respiratoire aigu sévère, caractérisée en ce que son génome présente sous la forme d’ADN complémentaire un codon sérine en position 23220-23222 du gène de la protéine S ou un codon glycine en position 25298-25300 du gène de l’ORF3, et un codon alanine en position 7918-7920 de l’ORF1a ou un codon sérine en position 26857-26859 du gène de la protéine M, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3. [0021] Selon un mode de réalisation avantageux de ladite souche, l’équivalent ADN de son génome présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ; cette souche de coronavirus est issue du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire d’un patient atteint de SRAS, répertorié sous le n° 031589 et effectué à l’hôpital français de Hanoi (Vietnam). [0022] Conformément à l’invention, ladite séquence SEQ ID NO :1 est celle de l’acide désoxyribonucléique correspondant à la molécule d’acide ribonucléique du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus. [0023] La séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY274119.3 (isolat Tor2) en ce qu’elle possède les mutations suivantes : - g/t en position 23220 ; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - a/g en position 25298 ; le codon arginine (aga) en position 11 de la séquence en acide aminés de la protéine codée par l’ORF3 de Tor 2 est remplacé par un codon glycine (gga). [0024] En outre, la séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY278741 (isolat Urbani) en ce qu’elle possède les mutations suivantes : - t/c en position 7919 ; le codon valine (gtt) en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l’ORF1a est remplacé par un codon alanine (gct), - t/c en position 16622 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l’ORF1b (mutation silencieuse), - g/a en position 19064 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l’ORF1b (mutation silencieuse), - c/t en position 24872 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et - c/t en position 26857 : le codon proline (ccc) en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M est remplacé par un codon sérine (tcc). [0025] En l’absence de mention particulière, les positions des séquences nucléotidiques et peptidiques sont indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3. EP 1 694 829 B1 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0026] La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence est celle du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus. [0027] Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO : 1. [0028] Les Inventeurs décrivent également un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus. [0029] Les termes « isolé ou purifié » signifient modifié « par la main de l’homme » à partir de l’état naturel ; autrement dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s’il a été modifié ou extrait de son environnement naturel ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant n’est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est « isolé » même s’il est présent dans ledit organisme. Le terme purifié tel qu’utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l’invention sont essentiellement libres d’association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l’est par exemple le produit purifié de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d’une source non-recombinante. [0030] On entend par conditions d’hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique choisies de telle manière qu’elles permettent le maintien de l’hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides complémentaires. [0031] A titre d’illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : l’hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt’s, 5 % de dextran sulfate et 1 % d’ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation pendant 20 heures à 42°C suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C. [0032] Les Inventeurs décrivent également un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est susceptible d’être obtenu, soit par l’utilisation d’enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par amplification à l’aide d’amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro, soit par synthèse chimique. [0033] Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par : l’ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi : ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11, ORF 13 et ORF 14, et l’ADNc correspondant aux extrémités 5’ ou 3’ non-codantes dudit polynucléotide. [0034] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences SEQ ID NO : 2 et 4 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-S qui code pour la protéine S, - les séquences SEQ ID NO : 13 et 15 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-E qui code pour la protéine E, - les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-M qui code pour la protéine M, - les séquences SEQ ID NO : 36 et 38 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N qui code pour la protéine N, - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement : aux ORF1a et ORF1b (ORF1ab, SEQ ID NO : 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO : 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO : 19, 20), à l’ORF13 (SEQ ID NO : 32) et à l’ORF 14 (SEQ ID NO : 34), et - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5’(SEQ ID NO : 39 et 72) et 3’ non-codantes (SEQ ID NO : 40, 73) dudit polynucléotide. [0035] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 5 et 6 (fragments Sa et Sb). [0036] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc correspondant aux ORF1a et ORF1b tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 41 à 54 (fragments L0 à L12). [0037] Les Inventeurs décrivent également un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce qu’il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s’agit d’un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400

Christian Mazuque le 18 Mars 2020 à 10h05
c'est quoi ce document........?????(19) EP 1 694 829 B1 (Cont. page suivante) &    (11) EP 1 694 829 B1 (12) FASCICULE DE BREVET EUROPEEN (45) Date de publication et mention de la délivrance du brevet: 04.08.2010 Bulletin 2010/31 (21) Numéro de dépôt: 04805625.3 (22) Date de dépôt: 02.12.2004 (51) Int Cl.: C12N 7/00(2006.01) (86) Numéro de dépôt international: PCT/FR2004/003106 (87) Numéro de publication internationale: WO 2005/056584 (23.06.2005 Gazette 2005/25) (54) NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU SRAS ET SES APPLICATIONS. NEUER MIT SARS VERBUNDEN CORONAVIRUS STAMM UND SEINE VERWENDUNGEN NOVEL STRAIN OF SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS AND APPLICATIONS THEREOF (84) Etats contractants désignés: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR (30) Priorité: 02.12.2003 FR 0314151 02.12.2003 FR 0314152 (43) Date de publication de la demande: 30.08.2006 Bulletin 2006/35 (60) Demande divisionnaire: 10005885.8 (73) Titulaires: • INSTITUT PASTEUR 75724 Paris Cedex 15 (FR) • CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) 75794 Paris Cedex 16 (FR) • UNIVERSITE PARIS VII 75251 Paris Cedex 05 (FR) (72) Inventeurs: • VAN DER WERF, Sylvie F-91190 Gif-sur-yvette (FR) • ESCRIOU, Nicolas F-75014 Paris (FR) • CRESCENZO-CHAIGNE, Bernadette F-92200 Neuilly-sur-seine (FR) • MANUGUERRA, Jean-Claude F-75018 Paris (FR) • KUNST, Frederik, Inst. Pasteur Bureau des Brevets et Inventions 75724 Paris Cedex 15 (FR) • CALLENDRET, Benoît F- 92000 Nanterre (FR) • BETTON, Jean-Michel 75014 Paris (FR) • LORIN, Valérie 92120 Montrouge (FR) • GERBAUD, Sylvie 94100 Saint Maur Des Fosses (FR) • BURGUIERE, Ana Maria 92140 Clamart (FR) • AZEBI, Saliha 94400 Vitry-sur-seine (FR) • CHARNEAU, Pierre 75005 Paris (FR) • TANGY, Frédéric 93260 Les Lilas (FR) • COMBREDET, Chantal 75017 Paris (FR) • DELAGNEAU, Jean-François 78170 La Celle Saint Cloud (FR) • MARTIN, Monique 92290 Chatenay Malabry (FR) (74) Mandataire: Marcadé, Véronique et al Cabinet Ores 36, rue de St Pétersbourg 75008 Paris (FR) (56) Documents cités: • DATABASE EMBL 22 avril 2003 (2003-04-22), XP002294758 Database accession no. AY278489 • DATABASE EMBL 10 juin 2003 (2003-06-10), XP002294760 Database accession no. AY290752 • DATABASE UNIPROT 10 octobre 2003 (2003-10-10), XP002294761 Database accession no. P59595 2 EP 1 694 829 B1 • MARRA M A ET AL: "The genome sequence of the SARS-associated coronavirus" SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE,, US, vol. 300, no. 5624, 30 mai 2003 (2003-05-30), pages 1399-1404, XP002269483 ISSN: 0036-8075 • CHE X-Y ET AL: "RAPID AND EFFICIENT PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SARS-ASSOCIATED CORONAVIRUS NUCLEOCAPSID PROTEIN BY IMMUNIZING MICE" DI YI JUNYI DAXUE XUEBAO - ACADEMIC JOURNAL OF FIRST MEDICAL COLLEGE OF PLA, GAI KAN BIANJISHI, GUANGZHOU, CN, vol. 23, no. 7, juillet 2003 (2003-07), pages 640-642, XP008028243 ISSN: 1000-2588 • WANG J ET AL: "ASSESSMENT OF IMMUNOREACTIVE SYNTHETIC PEPTIDES FROM THE STRUCTURAL PROTEINS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS" CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49, no. 12, 13 novembre 2003 (2003-11-13), pages 1989-1996, XP001182489 ISSN: 0009-9147 • SHI Y ET AL: "DIAGNOSIS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME (SARS) BY DETECTION OF SARS CORONAVIRUS NUCLEOCAPSID ANTIBODIES IN AN ANTIGENCAPTURING ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY" JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 41, no. 12, décembre 2003 (2003-12), pages 5781-5782, XP008028263 ISSN: 0095-1137 • LIU G ET AL: "The C-Terminal Portion of the Nucleocapsid Protein Demonstrates SARS-CoV Antigenicity" GENOMICS, PROTEOMICS AND BIOINFORMATICS, vol. 1, no. 3, 2003, pages 193-197, XP001183377 • POON LEO L M ET AL: "Rapid diagnosis of a coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome (SARS)" CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY. WINSTON, US, vol. 49, no. 6 Pt 1, juin 2003 (2003-06), pages 953-955, XP002288942 ISSN: 0009-9147 EP 1 694 829 B1 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Description [0001] La présente invention est relative à une nouvelle souche de coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), issue d’un prélèvement répertorié sous le n° 031589 et prélevé à Hanoi (Vietnam), à des molécules d’acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molécules d’acide nucléique ainsi qu’à leurs applications, notamment en tant que réactifs de diagnostic et/ou comme vaccin. [0002] Le coronavirus est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d’approximativement 30 kilobases qui se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes ; l’extrémité 5’ du génome a une structure en coiffe et l’extrémité 3’ comporte une queue polyA. Ce virus est enveloppé et comprend, à sa surface, des structures péplomériques dénommées spicules. [0003] Le génome comprend les cadres ouverts de lecture ou ORF suivants, de son extrémité 5’ vers son extrémité 3’ : ORF1a et ORF1b correspondant aux protéines du complexe de transcription-réplication, et ORF-S, ORF-E, ORFM et ORF-N correspondant aux protéines structurales S, E, M et N. Il comprend également des ORFs correspondant à des protéines de fonction inconnue codées par : la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant cette dernière, la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N, et la région incluse dans l’ORF-N. [0004] La protéine S est une glycoprotéine membranaire (200-220 kDa) qui se présente sous la forme de spicules ou "Spike" émergeant de la surface de l’enveloppe virale. Elle est responsable de l’attachement du virus aux récepteurs de la cellule hôte et de l’induction de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire. [0005] La petite protéine d’enveloppe (E) également dénommée sM (small membrane) qui est une protéine transmembranaire non glycosylée d’environ 10 kDa, est la protéine présente en plus faible quantité dans le virion. Elle joue un rôle moteur dans le processus de bourgeonnement des coronavirus qui se produit au niveau du compartiment intermédiaire dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi [0006] La protéine M ou protéine de matrice (25-30 kDa) est une glycoprotéine membranaire plus abondante qui est intégrée dans la particule virale par une interaction M/E, tandis que l’incorporation de S dans les particules est dirigée par une interaction S/M. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées. [0007] La protéine N ou protéine de nucléocapside (45-50 kDa) qui est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus, est nécessaire pour encapsider l’ARN génomique puis pour diriger son incorporation dans le virion. Cette protéine est vraisemblablement également impliquée dans la réplication de l’ARN. [0008] Lorsqu’une cellule hôte est infectée, le cadre de lecture (ORF) situé en 5’ du génome viral est traduit en une polyprotéine qui est clivée par les protéases virales et libère alors plusieurs protéines non-structurales telles que l’ARNpolymérase ARN dépendante (Rep) et l’ATPase hélicase (Hel). Ces deux protéines sont impliquées dans la réplication du génome viral ainsi que dans la génération de transcrits qui sont utilisés dans la synthèse des protéines virales. Les mécanismes par lesquels ces ARNms sub-génomiques sont produits, ne sont pas complètement compris ; cependant des faits récents indiquent que les séquences de régulation de la transcription à l’extrémité 5’ de chaque gène représentent des signaux qui régulent la transcription discontinue des ARNms sub-génomiques. [0009] Les protéines de la membrane virale (protéines S, E et M) sont insérées dans le compartiment intermédiaire, alors que l’ARN répliqué (brin +) s’assemble avec la protéine N (nucléocapside). Ce complexe protéine-ARN s’associe ensuite avec la protéine M incluse dans les membranes du réticulum endoplasmique et les particules virales se forment lorsque le complexe de la nucléocapside bourgeonne dans le réticulum endoplasmique. Le virus migre ensuite à travers le complexe du Golgi et éventuellement sort de la cellule, par exemple par exocytose. Le site de l’attachement du virus à la cellule hôte se trouve au niveau de la protéine S. [0010] Les coronavirus sont responsables de 15 à 30 % des rhumes chez l’Homme et d’infections respiratoires ou digestives chez les animaux, notamment le chat (FIPV : Feline infectious peritonitis virus), la volaille (IBV : Avian Infectious bronchitis virus), la souris (MHV : Mouse Hepatitis virus), le porc (TGEV : Transmissible gastroenterititis virus, PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV : Porcine Respiratory Coronavirus, HEV : Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) et les bovins (BcoV : Bovine coronavirus). [0011] En général, chaque coronavirus n’affecte qu’une seule espèce ; chez les individus immunocompétents, l’infection induit des anticorps éventuellement neutralisants et une immunité cellulaire, capables de détruire les cellules infectées. [0012] Une épidémie de pneumonie atypique, dénommée syndrome respiratoire aigu sévère (SARS ou Severe acute respiratory syndrome, SRAS en français) s’est propagée dans différents pays (Vietnam, Hong-Kong, Singapour, Thaïlande et Canada) au cours du premier trimestre 2003, à partir d’un foyer initial apparu en Chine dans le dernier trimestre de 2002. La sévérité de cette maladie est telle que son taux de mortalité est d’environ 3 à 6 %. La détermination de l’agent causatif de cette maladie a été entreprise par de nombreux laboratoires, à travers le monde. [0013] En mars 2003, un nouveau coronavirus (SARS-CoV, SARS virus ou virus SRAS, en français) a été isolé, en association avec des cas de syndrome respiratoire aigu sévère (T.G.KSIAZEK et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330 ; C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976 ; EP 1 694 829 B1 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-). [0014] Des séquences génomiques de ce nouveau coronavirus ont ainsi été obtenues, notamment celles de l’isolat Urbani (Genbank n° d’accès AY274119.3 et A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) et de l’isolat de Toronto (Tor2, Genbank n° d’accès AY 278741 et A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394-1399). [0015] L’organisation du génome est comparable à celle des autres coronavirus connus permettant ainsi de confirmer l’appartenance du SARS-CoV à la famille des Coronaviridae ; les cadres ouverts de lecture ORF1a et 1b et les cadres ouverts de lecture correspondant aux protéines S, E, M, et N, ainsi qu’à des protéines codées par : la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E (ORF3), la région située entre l’ORF-S et l’ORF-E et chevauchant l’ORF-E (ORF4), la région située entre l’ORF-M et l’ORF-N (ORF7 à ORF11) et la région correspondant à l’ORF-N (ORF13 et ORF14), ont notamment été identifiées. [0016] Sept différences ont été mises en évidence entre les séquences des isolats Tor2 et Urbani ; 3 correspondent à des mutations silencieuses (c/t en position 16622 et a/g en position 19064 de l’ORF1b, t/c en position 24872 de l’ORFS) et 4 modifient la séquence en acides aminés de respectivement : les protéines codées par l’ORF1a (c/t en position 7919 correspondant à la mutation A/V), la protéine S (g/t en position 23220 correspondant à la mutation A/S), la protéine codée par l’ORF3 (a/g en position 25298 correspondant à la mutation R/G) et de la protéine M (t/c en position 26857 correspondant à la mutation S/P). [0017] En outre, l’analyse phylogénétique montre que le SARS-CoV est éloigné des autres coronavirus et qu’il est apparu, ni par mutation de coronavirus respiratoires humains, ni par recombinaison entre des coronavirus connus (pour une revue, voir Holmes, J.C.I., 2003, 111, 1605-1609). [0018] La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour la mise au point de réactifs de détection et de diagnostic du SRAS suffisamment sensibles et spécifiques ainsi qu’à des compositions immunogènes aptes à protéger des populations contre des épidémies de SRAS. [0019] Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une autre souche de coronavirus associé au SRAS, qui se distingue des isolats Tor2 et Urbani. [0020] La présente invention a donc pour objet, une souche isolée ou purifiée de coronavirus humain associé au syndrome respiratoire aigu sévère, caractérisée en ce que son génome présente sous la forme d’ADN complémentaire un codon sérine en position 23220-23222 du gène de la protéine S ou un codon glycine en position 25298-25300 du gène de l’ORF3, et un codon alanine en position 7918-7920 de l’ORF1a ou un codon sérine en position 26857-26859 du gène de la protéine M, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3. [0021] Selon un mode de réalisation avantageux de ladite souche, l’équivalent ADN de son génome présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ; cette souche de coronavirus est issue du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire d’un patient atteint de SRAS, répertorié sous le n° 031589 et effectué à l’hôpital français de Hanoi (Vietnam). [0022] Conformément à l’invention, ladite séquence SEQ ID NO :1 est celle de l’acide désoxyribonucléique correspondant à la molécule d’acide ribonucléique du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus. [0023] La séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY274119.3 (isolat Tor2) en ce qu’elle possède les mutations suivantes : - g/t en position 23220 ; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - a/g en position 25298 ; le codon arginine (aga) en position 11 de la séquence en acide aminés de la protéine codée par l’ORF3 de Tor 2 est remplacé par un codon glycine (gga). [0024] En outre, la séquence SEQ ID NO : 1 se distingue de la séquence Genbank AY278741 (isolat Urbani) en ce qu’elle possède les mutations suivantes : - t/c en position 7919 ; le codon valine (gtt) en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l’ORF1a est remplacé par un codon alanine (gct), - t/c en position 16622 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l’ORF1b (mutation silencieuse), - g/a en position 19064 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l’ORF1b (mutation silencieuse), - c/t en position 24872 : cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et - c/t en position 26857 : le codon proline (ccc) en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M est remplacé par un codon sérine (tcc). [0025] En l’absence de mention particulière, les positions des séquences nucléotidiques et peptidiques sont indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3. EP 1 694 829 B1 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0026] La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence est celle du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus. [0027] Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO : 1. [0028] Les Inventeurs décrivent également un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus. [0029] Les termes « isolé ou purifié » signifient modifié « par la main de l’homme » à partir de l’état naturel ; autrement dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s’il a été modifié ou extrait de son environnement naturel ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant n’est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est « isolé » même s’il est présent dans ledit organisme. Le terme purifié tel qu’utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l’invention sont essentiellement libres d’association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l’est par exemple le produit purifié de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d’une source non-recombinante. [0030] On entend par conditions d’hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique choisies de telle manière qu’elles permettent le maintien de l’hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides complémentaires. [0031] A titre d’illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : l’hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt’s, 5 % de dextran sulfate et 1 % d’ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation pendant 20 heures à 42°C suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C. [0032] Les Inventeurs décrivent également un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est susceptible d’être obtenu, soit par l’utilisation d’enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par amplification à l’aide d’amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro, soit par synthèse chimique. [0033] Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par : l’ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi : ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11, ORF 13 et ORF 14, et l’ADNc correspondant aux extrémités 5’ ou 3’ non-codantes dudit polynucléotide. [0034] Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences SEQ ID NO : 2 et 4 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-S qui code pour la protéine S, - les séquences SEQ ID NO : 13 et 15 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-E qui code pour la protéine E, - les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-M qui code pour la protéine M, - les séquences SEQ ID NO : 36 et 38 représentant l’ADNc correspondant à l’ORF-N qui code pour la protéine N, - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement : aux ORF1a et ORF1b (ORF1ab, SEQ ID NO : 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO : 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO : 19, 20), à l’ORF13 (SEQ ID NO : 32) et à l’ORF 14 (SEQ ID NO : 34), et - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5’(SEQ ID NO : 39 et 72) et 3’ non-codantes (SEQ ID NO : 40, 73) dudit polynucléotide. [0035] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 5 et 6 (fragments Sa et Sb). [0036] Les Inventeurs décrivent également un fragment de l’ADNc correspondant aux ORF1a et ORF1b tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 41 à 54 (fragments L0 à L12). [0037] Les Inventeurs décrivent également un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce qu’il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s’agit d’un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400
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