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Les progrès techniques dans le domaine de la miniaturisation permettent de fabriquer des minis laboratoires de la taille d’une puce électronique. Ces laboratoires sur puce représentent de formidables outils de recherche pour étudier des phénomènes biologiques à l’échelle de la cellule, comme la production de virus par exemple.

Imaginez de pouvoir isoler une cellule infectée par un virus afin d’observer en direct comment celle-ci relargue des particules virales infectieuses, les virions. Et bien c’est chose faite grâce à des laboratoires sur puce développés par l’équipe de scientifiques du projet Virofluidics1. À l’origine, c’est Marylène Mougel, biologiste à l’Institut de recherche en infectiologie de Montpellier2, qui, il y a près de dix ans, a eu cette idée d’étudier en temps réel la production de virus à l'échelle d’une seule cellule. Les approches conventionnelles sont en effet conduites sur des populations cellulaires. Or, chaque cellule réagit de manière spécifique à l’invasion virale ce qui impacte la production et la libération des virions. Afin de mener son idée à terme, la virologiste, spécialiste des virus à ARN3 comme le VIH responsable du Sida, a sollicité l’aide de Marius Socol, ingénieur de recherche en expérimentation biophysique à l’IRIM, et de Benoît Charlot, chercheur spécialiste des techniques de fabrication de ces laboratoires sur puce à l’Institut d'électronique et des systèmes4 de Montpellier.

Des puces « microfluidiques »

« Ces techniques, regroupées sous le terme de microfluidique, sont adaptées de procédés utilisés en microélectronique », précise Marius Socol, aujourd’hui responsable du plateau de microfluidique de l’IRIM et coordinateur du projet Virofluidics. En lieu et place d’un courant électrique qui se déplace dans un circuit imprimé, ici ce sont des liquides, des fluides donc, qui à l’aide de mini-pompes et de robinets circulent en flux continu dans des canaux de l'ordre du micromètre, d’où le terme de puces microfluidiques. « Pour les fabriquer, la méthode la plus simple et la moins coûteuse est la réplication par moulage, poursuit l’ingénieur de recherche. D’abord une résine photosensible est étalée uniformément sur une galette très fine de silicium avant d’être exposée à la lumière UV à travers un masque optique qui représente le futur design des canaux. Les parties exposées vont alors durcir. » La résine qui n’a pas durci est éliminée et un moule est obtenu. Une sorte de silicone liquide et transparent, le polydiméthylsiloxane ou PDMS, est ensuite coulée dans ce moule qui est placé dans un four à une température d’environ 80 °C. « Le PDMS va polymériser et en le démoulant nous obtenons une réplique avec les microcanaux désirés. » Il suffit alors de sceller cette réplique translucide sur une lame de verre pour obtenir l’architecture d’une puce microfluidique. Ce procédé dit de photolithographie est réalisé en « salle blanche », un environnement propre où le nombre de particules dans l'air ainsi que la température et l’humidité sont contrôlés. Pour accéder à une telle infrastructure, l’équipe de Virofluidics est allée frapper à la porte de Benoît Charlot à l’IES.
_{Puce en PDMS sous la lumière d’excitation bleue (480 nm) © Joelle Eid}

Un dispositif expérimental sur mesure

Ce chercheur en biophysique a aussi joué un rôle important dans la conception des canaux. « Leur design dépend des besoins de la recherche, ajoute Marius Socol. Dans notre cas, nous cherchions à individualiser une seule cellule de l’ensemble de celles qui sont injectées dans la puce microfluidique. Après plusieurs essais, nous avons obtenu les meilleurs résultats en plaçant perpendiculairement au canal principal des canaux secondaires dans lesquels deux plots de PDMS permettent de piéger une cellule unique. »

_{Une cellule HeLa ( ~ 12 microns) dans un piège sous flux continu © Joelle Eid}

Le flux continu de liquide dans la puce, ici un milieu de culture qui favorise la survie des cellules, permet d’évacuer dans ces microcanaux secondaires tout ce que produit la cellule piégée, par exemple des virions si cette dernière est infectée par un virus. En associant ce type de puce à un système de détection, il est alors possible d’étudier certains aspects du fonctionnement des cellules piégées dans ces canaux. Pour leurs travaux sur les virus, les scientifiques de Virofluidics se sont associés à Emmanuel Margeat du Centre de biologie structurale5 de Montpellier, spécialiste du suivi de particules par microscopie. « Notre idée est de modifier le génome des virus en y insérant le gène d’une protéine fluorescente verte appelée GFP6. La cellule infectée produit alors des virions fluorescents qui peuvent être détectés par un microscope à fluorescence », précise Marius Socol.
_{Image synthétisant le projet Virofluidics : de gauche à droite : 2 cellules HeLa individualisées en parallèle ; dessin artistique d’une cellule entre 2 plots de PDMS ; microscopie électronique de la résine sur une galette de silicium montrant l’emplacement de futurs plots de pièges et un kymographe de virions dans un canal de détection. © Marius Socol / Benoît Charlot.}

Du VIH au MLV

Une fois ce plateau expérimental mis au point, les scientifiques du projet Virofluidics se sont attachés à démontrer son intérêt avec des sortes d’avatar du VIH qui produisent des pseudo-particules virales. Celles-ci, telles des coquilles vides, présentent une structure qui ressemble au virus responsable du Sida mais ne sont pas infectieuses. Ce travail, réalisé pour la thèse doctorale de Joëlle Eid, a permis de quantifier la production de ces pseudo-particules virales par les cellules infectées. « Nous avons observé des cinétiques d’environ 50 particules par cellule et par heure. De façon intéressante, la production virale s’effectuait selon un schéma irrégulier, avec des vagues de production toutes les trois à quatre minutes », poursuit l’ingénieur de recherche. Ces à-coups pourraient être dus à une ou plusieurs étapes limitantes dans le mécanisme de production des virions. Des résultats qui soulignent l’intérêt biologique de ce dispositif pour mieux comprendre les dynamiques de production virale à l’échelle de la cellule individuelle. Après cette preuve de concept, l’équipe de Virofluidics a récidivé avec une expérience plus proche de la réalité biologique en infectant des cellules avec le virus complet de la leucémie murine, ou MLV, qui, comme son nom l’indique, provoque des leucémies chez la souris. Là encore, « notre puce microfluidique a très bien fonctionné et permet une détection au virus près », se réjouit Marius Socol. Les scientifiques ont ainsi dénombré une production d’environ 400 virions de MLV par cellule et par heure. Outre ces virus à ARN, ce type de puce microfluidique pourrait se révéler utile pour étudier d’autres pathogènes mais aussi des propriétés des cellules comme leur adhérence ou encore pour en savoir plus sur le métabolisme de micro-organismes tels que les levures. Des projets en ce sens sont d’ailleurs en cours à l’IRIM. Un bel avenir en perspective pour ces puces microfluidiques.

_{Capture d’un seul virion en mouvement (~250 microns/s) dans les canaux de détections © Marius Socol}

Publication :
Joëlle Eid et al. Biophyscial reports, 14 septembre 2022 ; 2(3):100068
DOI: 10.1016/j.bpr.2022.100068

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Ces recherches ont été financées en tout ou partie, par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) au titre de l'ANR Virofluidics - AAPG2020. Cette communication est réalisée et financée dans le cadre de l’appel à projet Science Avec et Pour la Société - Culture Scientifique Technique et Industrielle pour les projets JCJC et PRC des appels à projets génériques 2020 (SAPS-CSTI JCJC et PRC AAPG 20).